L’ottenimento di “ibridi cellulari” attraverso la “fusione” di cellule somatiche coltivate in vitro, ha creato la possibilità di fare l’analisi genetica negli organismi superiori sfrattando i fenomeni parasessuali che avvengono in questi ibridi (Pontecorvo G. 1962 – Methods of microbiol genetics in an approach to human genetics. Brit. Med. Bull. N° 18 pag. 81).

La prima tappa fondamentale nel campo dell’ibridazione cellulare è senza dubbio rappresentata da un lavoro fatto da Barski nel 1960 (C.R. Acc. Sci (Paris) n° 251 pag. 1825.)

Questi, allevando in coltura mista cellule di due linee tumorali di topo, ha riscontrato dopo alcuni mesi che nella coltura era presente un terzo tipo di cellule, cioè un ibrido delle due cellule parentali. Tale ibrido fa caratterizzato quantitativamente (il numero totale dei cromosomi è molto vicino alla somma del numero modale dei cromosomi delle due linee parentali) e qualitativamente (sono presenti i cromosomi di entrambe le linee parentali.).

Molto lavoro in questa direzione è stato fatto dal gruppo di Ephrussi il quale nel 1964 (Hybridization of somatic cells in vitro Acad Press New York n° 3 pag. 13) arriva a queste conclusioni:

  1. L’ibridazione somatica può avvenire tra linee stabilizzate di topo distinguibili tra loro;
  2. L’ibridazione somatica può avvenire tra linee diploidi di topo e linee stabilizzate di topo;
  3. Tali ibridi, una volta isolati, sono capaci di moltiplicarsi;
  4. I caratteri di entrambe le cellule parentali sono espressi nella cellula ibrida;
  5. In questi ibridi, come atteso, si osserva la dominanza, la codominanza, la recessività e la complementazione dei marcatori genetici;
  6. I sistemi per selezionare tali ibridi sono disponibili.

Un nuovo e importante sviluppo in queste ricerche fu promosso dalla messa a punto di una tecnica di fusione cellulare mediata da virus (Harris – 1965 – Nature n.ri 205 e 206).

Harris (1970 – cell fusion) sviluppando un’idea del giapponese Okada riuscì a mettere a punto un metodo per la formazione rapida d’ibridi cellulari somatici sfruttando la conoscenza che in vivo e anche in vitro alcuni virus hanno la capacità di provocare la fusione cellulare. I virus più attivi sono i Paramixovirus (morbillo, virus Sendaii ecc.) e il virus Sendaii, (virus RNA) è quello che è stato usato da Harris nei suoi esperimenti.

Il virus, una volta inattivato con alte dosi di UV allo scopo di impedirgli la moltiplicazione e quindi la distruzione delle cellule, è miscelato alle cellule parentali.

Con questa tecnica, rispetto alla fusione spontanea, si ha una rapida formazione oltre che a un maggior numero di fusioni cellulari.

Fusione cellulare

Il fattore responsabile di tale fusione sembra che sia la proteina di rivestimento e non l’acido nucleico (RNA). Infatti, se si tratta il virus con ultrasuoni (gli ultrasuoni alterano principalmente le proteine del rivestimento) non si riscontrano fusioni cellulari nella coltura; inoltre se alle sospensioni cellulari si aggiunge solamente l’estratto proteico del virus, la fusione cellulare è indotta (Harris – 1970 – cell fusion).

I motivi per i quali due cellule si fondono più facilmente in presenza del virus non sono molto noti. Alcuni (Okada – 1962 – Exp. Cell Res n. 26 pag 98) ritengono che il virus produca delle discontinuità sulla membrana cellulare e che la fusione tra due cellule si verifichi a livello di queste discontinuità. Studi effettuati col microscopio elettronico non hanno fornito dati sufficienti per dimostrare che ciò avvenga realmente.

Altri (Hosaka – 1968 – Virology n. 34 pag. 419) suggeriscono invece che le particelle virali costituiscono un ponte tra due cellule vicine. Il primo segno della fusione è dato dalla formazione di minuti ponti citoplasmatici sulle facce adiacenti di due cellule.

La fusione cellulare avviene più facilmente tra cellule che presentano una membrana irregolare, in special modo le cellule di linee tumorali e quelle cellule che sono state coltivate per lungo tempo in vitro. Comunque vengono fuse, anche se in intervalli maggiori di tempo, cellule con membrane regolari.

Con questa tecnica si possono ottenere ibridi tra cellule della stessa specie o di differenti specie animali (uomo con una larga parte del sub filum dei vertebrati); questo tra l’altro fornisce una nuova prova a favore dell’interpretazione Darwiniana dell’evoluzione. Il fatto che due cellule si fondono, però non vuol dire che i due genomi possano coesistere indefinitamente: quando, infatti, due specie sono molto lontane, i cromosomi di una specie sono completamente rigettati. Una volta avvenuta la fusione cellulare, si ha una cellula polinucleata.

Sperimentalmente si è visto che mescolando una sospensione di cellule HeLa e, una di cellule Ehrlich, i cui nuclei sono facilmente distinguibili, si ottengono cellule ibride che possiedono nuclei HeLa ed Ehrlich; si è constatato anche che i nuclei all’interno delle cellule sono proporzionali al rapporto HeLa/Ehrlich usato nelle sospensioni iniziali e che entrambi i genomi sono funzionalmente attivi.

Anche la sintesi del DNA subisce delle modificazioni: infatti, la replicazione del DNA delle due cellule si sincronizza (Harris – 1970 – cell fusion). Il fatto responsabile della sincronizzazione sembra essere la dominanza metabolica. Difatti si è notato che, quando due cellule nella fase S sono fuse con cellule nella fase G1, la sintesi del DNA viene imposta in queste cellule quiescenti e che questo stato viene raggiunto abbastanza rapidamente (Harris – 1970 – cell fusion).

Fusione Nucleare

La presenza di più nuclei autonomi non è indefinita, anche se in natura ci sono delle forme sinciziali dove possono essere presenti più nuclei in una cellula (per esempio: le cellule dei muscoli striati); accadono, infatti, degli eventi che portano alla formazione di un nucleo singolo. I meccanismi possibili sono due:

  1. I due nuclei entrano in mitosi insieme, tutti i cromosomi si allineano sulla piastra metafisica e avviene una divisione che porta alla formazione di due cellule figlie, che contengono in un singolo nucleo i cromosomi delle due specie parentali.
  2. I due nuclei si preparano alla mitosi (dissoluzione della membrana nucleare ecc..) ma la divisione cellulare non avviene per cui la conseguente ricostruzione postmitotica porta alla formazione di un grosso nucleo dai precedenti nuclei parentali.

Sostanzialmente l’introduzione della tecnica di fusione mediata da virus nel campo dell’ibridazione ha permesso in opportune condizioni tecniche (Yerganian e Nell – 1966 – Proc. Nat. Acad. Sci. USA n. 55 pag. 1066) di realizzare ibridi cellulari sia omospecifici sia etero specifici. La differenza sostanziale tra i due tipi d’ibridi è rappresentata dal fatto che gli ibridi omospecifici sono abbastanza stabili al contrario di quelli etero specifici i quali, nella maggior parte dei casi, vanno incontro a una continua perdita di cromosomi. S’intuisce facilmente quindi come gli ibridi etero specifici di questo tipo siano particolarmente utili per ricerche sulla localizzazione cromosomica di marcatori genetici propri del genoma che è eliminato. La perdita dei cromosomi nelle generazioni successive all’ibridazione è in pratica equivalente ai fenomeni di segregazione e ricombinazione che accadono nelle cellule germinali, rendendo così possibile anche la scoperta di eventuali gruppi di linkare.

L’utilità di questo tipo di ciclo parasessuale per l’analisi genetica è che esso può costituire per l’uomo un metodo alternativo rispetto all’incrocio e alle analisi familiari. Il ciclo parasessuale, modello Aspergillus, comporta una fase di eterocariosi seguita da fusione nucleare e una fase di riduzione cromosomica che può riportare al grado di ploidia delle cellule parentali. Nei microorganismi quest’ultima fase è rappresentata dall’aploidizzazione. Nelle cellule ibride dei mammiferi il fenomeno avviene a un livello di ploidia diverso (2n) ma la sequenza degli eventi è la stessa. Una differenza importante rispetto al sistema Aspergillus è costituita dalla perdita cromosomica che generalmente non è graduale, per singolo elemento, ma massiva. Mentre quindi non esistono in pratica limitazioni per quanto riguarda la fusione cellulare, la riduzione cromosomica è un fenomeno incontrollabile circoscritto a particolari tipi d’ibrido.

Alcuni ricercatori (Martin e Sprague – 1969 – Science n. 166 pag 761), utilizzando una variante citologica di fibroblasti umani, furono in grado di dimostrare la segregazione spontanea in vitro di cellule tetraploidi attraverso la formazione di mitosi tetrapolari. La possibilità di introdurre e controllare la segregazione cromosomica (11,12,13) estenderebbe l’applicazione dei metodi di analisi genetica a una vasta gamma d’ibridi e valorizzerebbe meglio gli ibridi intraspecifici che maggiormente si prestano allo studio della genetica dei caratteri differenziati.

La perdita dei cromosomi non è casuale ma specie-specifica a seconda dei diversi tipi d’ibridi cellulari, come si può vedere nella tabella:

Incrocio

Genoma segregante

Autori

Ratto x Topo

Ratto

Weiss & Ephrussi – 1966

Topo x Criceto cinese

Topo

Scaletta e alt. – 1967

Uomo x Topo

Uomo

Weiss & Green – 1967

Topo x Criceto siriano

Topo

Migeon – 1968

Ratto x Uomo

Ratto

Van Went e alt. – 1971

Ratto canguro x Criceto cinese

Ratto canguro

Jakob e alt. – 1970

Topo x Scimmia

Scimmia

Cassingena e alt. – 1971

Uomo x Criceto cinese

Uomo

Westervold – 1971

Uomo x Criceto siriano

Uomo

Crzeshik e alt. – 1972

Mulo x Topo

Mulo

Dejs e alt. – 1972

 

Parecchi meccanismi sono stati suggeriti per spiegare la specie-specificità della perdita cromosomica. Originariamente si è pensato che i cromosomi di una specie fossero persi a causa della differente velocità di replicazione tra le due cellule parentali; ciò porterebbe alla perdita preferenziale dei cromosomi della specie più lenta a replicarsi. Questa spiegazione contrasta con almeno due risultati sperimentali. Infatti, non sempre sono persi i cromosomi della specie che è più lenta a crescere e inoltre, come abbiamo visto prima, all’interno dei nuclei si stabilisce una sincronizzazione nella replicazione del DNA. Un’altra ipotesi per la perdita preferenziale dei cromosomi di una specie in cellule ibride si basa sulla seguente osservazione: quando si seleziona per un ibrido, sia esso omo o etero specifico, la perdita di un cromosoma è seguita dalla perdita di altri cromosomi in modo che sembra non casuale. Quest’osservazione fa supporre che esistono delle interazioni funzionali fra geni di differenti cromosomi tali che una deficienza, causata dalla perdita di un cromosoma, sia bilanciata da altre deficienze specifiche cioè dalla perdita di altri cromosomi. Forse questo tipo d’interazione gioca un ruolo importante nella perdita cromosomica negli ibridi cellulari, però non è facile individuare il motivo per cui, ad esempio nell’ibrido uomo-topo, il primo cromosoma perso è sempre inevitabilmente umano e mai murino.

La terza ipotesi cerca di correlare la perdita dei cromosomi con la specificità dell’apparato mitotico. Anzitutto si è osservato che l’apparato mitotico è molto importante nell’eliminazione in vivo dei cromosomi in ibridi interspecifici. Incrociando Echinus Esculentis con E. Miliaris una buona percentuale di uova si sviluppa e mostra l’eliminazione di alcuni cromosomi di una specie alla prima divisone; studiando la cinetica dell’eliminazione in vivo, si vede che la velocità di eliminazione è molto alta; generalmente si ha eliminazione dei cromosomi durante la prima divisione mitotica. Ora confrontando la cinetica di eliminazione che si ha in questi ibridi con quella degli ibridi cellulari dei mammiferi, si potrebbe stabilire una correlazione sul sistema di eliminazione dei cromosomi.

Sfortunatamente non si può fornire una prova definitiva a favore di questa teoria perché è difficilissimo studiare i vitro la cinetica di eliminazione nelle prime divisioni cellulari.

Pur non conoscendo con quale meccanismo avviene l’eliminazione dei cromosomi, possiamo dire che la perdita è un fenomeno non casuale e che la loro ritenzione è dovuta a qualche fenomeno di adattamento.

Per quanto riguarda la velocità con cui sono persi, si è visto che essa è molto alta nelle prime generazioni e si riduce man mano che aumenta il numero di generazioni.

In un ibrido uomo-topo (Weiss, Green – 1967 – Proc. Natl. Acad. Sci. USA n. 58 pag. 1104) è stato riscontrato che dopo 20 generazioni il numero dei cromosomi umani da 46 si era ridotto a circa 9 cromosomi e dopo 100-150 generazioni a circa 2 cromosomi.

Con le tecniche di bandeggio dei cromosomi oggi disponibili, riconoscere i cromosomi umani non costituisce più un problema, per cui l’evoluzione del cariotipo di un ibrido è sperimentalmente facile da seguire.